PIERCE超敏型發(fā)光液使用方法簡單說說
瀏覽次數(shù)：1573發(fā)布日期：2022-06-22
PIERCE超敏型發(fā)光液用于檢測直接或間接標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。其原理是，蛋白質(zhì)或核酸在電泳后轉(zhuǎn)移到印跡膜上，以一抗及HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合膜上的目的蛋白，或以HRP標(biāo)記的探針直接或間接結(jié)合膜上的核酸。洗膜后用本產(chǎn)品配制的ECL工作液，室溫孵育膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)小時(shí)，顯影定影后蛋白質(zhì)或核酸條帶可清晰顯示在X光膠片上。
采用*的發(fā)光底物系統(tǒng)，降低曝光背景的同時(shí)引入新型的氧化劑，大大提高試劑盒的穩(wěn)定性，使其在室溫能穩(wěn)定放置一年。除用于X光片，還可直接使用熒光CCD掃描，主要用于WB檢測以及化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)。
PIERCE超敏型發(fā)光液使用方法:
1.常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP標(biāo)記抗體或核酸探針孵育、洗膜。注意用HRP標(biāo)記lgG或用一抗-鏈親和素-HRP夾法。核酸雜交膜用HRP標(biāo)記探針雜交，洗膜。
2.洗滌膜上的HRP標(biāo)記二抗時(shí)，配制新鮮發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液A和B混合，放置使之升到室溫否則會(huì)減弱熒光強(qiáng)度。建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。
3.用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜*干燥。將膜*浸入并與發(fā)光工作液(0.125ml發(fā)光工作液/cm2膜)充分接觸。室溫孵育1分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。孵育時(shí)間過長不會(huì)增加靈敏度，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，使用過少的發(fā)光工作液不利于反應(yīng)進(jìn)行，也會(huì)導(dǎo)致膜上條帶曝光不均，明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。
4.用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。
5.在X光膠片暗盒內(nèi)面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將雜交膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來*包裹雜交膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋雜交膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。
6.在黑暗中放入X光膠片，分別曝光不同的時(shí)間如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。
PIERCE超敏型發(fā)光液注意事項(xiàng)：
1.步驟1-5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。
2.長時(shí)間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。
3.發(fā)光工作液孵育約1分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。
4.由于PIERCE超敏型發(fā)光液極其靈敏，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000-1:4000，二抗1:2000-1:5000?？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導(dǎo)致失敗!
